河北MDCK宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)常用知識(shí)

湖州申科生物自主研發(fā)生產(chǎn)的系列宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)試劑盒利用qPCR（Taqman探針）法定量檢測(cè)各種宿主細(xì)胞殘留 DNA（rHCD），覆蓋各種工程細(xì)胞和載體，如細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物源細(xì)胞、人源細(xì)胞、基因載體等。檢測(cè)快速，專一性強(qiáng)，性能可靠，定量限可以達(dá)到 fg 水平。配套 SHENTEK宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒使用，可在5小時(shí)內(nèi)完成樣品前處理和分析檢測(cè)。若用戶需要，亦可選購(gòu)IPC（報(bào)告基團(tuán) VIC），配合各宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)試劑盒使用。

SHENTEK^® Hi5&AcNPV 殘留 DNA 檢測(cè)試劑盒（多重 PCR-熒光探針法）用于定量檢測(cè)昆蟲細(xì)胞（High Five）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源的基因工程疫苗中殘留的 Hi5 細(xì)胞 DNA和桿狀病毒（AcNPV）DNA 的試劑盒。本試劑盒利用熒光探針原理，采用多重 qPCR 的方法定量檢測(cè)樣品中 Hi5 和 AcNPV殘留 DNA。檢測(cè)快速，專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠，檢測(cè)限可以達(dá)到 50 copies/反應(yīng)。試劑盒配套有 Hi5&AcNPV 定量參考品。本試劑盒與 SHENTEK^®宿主細(xì)胞殘留 DNA 樣本前處理試劑盒配套使用，可準(zhǔn)確定量樣品中殘留的 Hi5&AcNPV 微量 DNA。

在宿主細(xì)胞殘留 DNA 檢測(cè)中，若回收率不合格，可按以下思路排查。先看 PCS/NCS，檢查 PCS 回收率是否合格、計(jì)算公式是否正確，以及 NCS 質(zhì)控是否合格 。接著排查試劑 / 耗材，確認(rèn)洗滌液 B 是否過(guò)期或配制錯(cuò)誤，異丙醇是否為分析純，常溫試劑有無(wú)結(jié)晶，試劑儲(chǔ)存溫度是否合適，磁珠是否難重懸 。再關(guān)注樣品，了解樣品殘留量、加標(biāo)量是否合適，pH 值是否異常，是否含抑制因子干擾磁珠作用和 PCR 實(shí)驗(yàn) 。以上排查完再審視操作過(guò)程，查看樣品是否完全消化、消化后狀態(tài)是否可流動(dòng)，磁珠是否復(fù)溫，洗滌 / 洗脫中磁珠狀態(tài)、是否被誤丟棄，洗脫前磁珠是否過(guò)干燥等 。

在宿主細(xì)胞殘留 DNA（HCD）檢測(cè)試劑盒更換時(shí)，需進(jìn)行系列驗(yàn)證考量。首先參考《已上市生物制品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，依對(duì)生物制品安全性、有效性和質(zhì)量可控性的風(fēng)險(xiǎn)及影響程度分類，實(shí)施變更要開展充分研究與驗(yàn)證 。接著做全面性能驗(yàn)證，用藥典或經(jīng)驗(yàn)證檢測(cè)方法，證明變更后分析方法等效或更優(yōu) 。然后進(jìn)行樣品檢驗(yàn)，對(duì)比變更前后產(chǎn)品質(zhì)量數(shù)據(jù)并綜合評(píng)估，借穩(wěn)定性研究開展穩(wěn)定性可比性分析，檢測(cè)細(xì)微差異，評(píng)價(jià)變更對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響 。以上完成后再進(jìn)行更換試劑盒備案，若變更后方法同原方法或更優(yōu)，據(jù)待檢樣品是原液或制劑，分屬中等或微小變更，微小變更可在中等變更申請(qǐng)時(shí)一并說(shuō)明 。

關(guān)于宿主細(xì)胞殘留DNA（rDNA）的風(fēng)險(xiǎn)研究，主要包括傳染性、致病性、免疫原性等，各國(guó)藥典對(duì)其殘留量有著嚴(yán)格的限度要求：美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布的指導(dǎo)原則中指出生物制品宿主細(xì)胞DNA殘留限度不得超過(guò)100 pg/劑，對(duì)于大劑量的生物制品（如單克隆抗體），根據(jù)其殘留DNA來(lái)源及給藥途徑，DNA殘留量可放寬至10 ng/劑?！稓W洲藥典》通則規(guī)定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過(guò)10 ng/劑。2025版《中國(guó)藥典》三部規(guī)定，以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑DNA殘留量不能超過(guò)100 pg/劑。

宿主細(xì)胞殘留DNA非常主要的轉(zhuǎn)化潛能源于其可能攜帶活性的顯性轉(zhuǎn)化基因（例如 myc、經(jīng)過(guò)特定修飾的 ras）。這類基因擁有顯性遺傳特性，其表達(dá)產(chǎn)物能夠直接賦予正常細(xì)胞獲得性功能，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化并形成不適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)特性，導(dǎo)致部分細(xì)胞獲得異常生長(zhǎng)特性（這一點(diǎn)已被眾多嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭?dòng)物模型實(shí)驗(yàn)所證實(shí)）。與這種直接的強(qiáng)力作用相比，殘留DNA片段通過(guò)插入宿主基因組位點(diǎn)誘發(fā)特定的關(guān)鍵基因（如影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵控制點(diǎn)或關(guān)鍵生長(zhǎng)調(diào)控基因）失活或過(guò)度處于活性狀態(tài)的機(jī)制，發(fā)生的頻率被認(rèn)為相對(duì)較低。具體而言，在某個(gè)特定的關(guān)鍵位置發(fā)生整合，從而抑制一個(gè)關(guān)鍵的生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控基因或異?；罨粋€(gè)促進(jìn)生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因，其產(chǎn)生的概率和總體頻率也受到相當(dāng)大的限制。