微流控芯片與生物反應(yīng)器的微凝膠培養(yǎng)

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間：2025-08-08

本文開(kāi)發(fā)了一種微流控體外細(xì)胞封裝平臺(tái)，用于研究 3D 微環(huán)境參數(shù)對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的影響。該平臺(tái)基于酶交聯(lián)的聚乙二醇（PEG）基微凝膠，其機(jī)械特性（彈性 300-3000 Pa）、生化特性（如整合素結(jié)合肽 RGD）和降解性（含 MMP 底物或非降解肽）可精確調(diào)控，成功封裝了成纖維細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞（ESCs）、*細(xì)胞等多種細(xì)胞。通過(guò)優(yōu)化（如添加 OptiPrep 調(diào)節(jié)密度、延長(zhǎng)胰蛋白酶處理時(shí)間），細(xì)胞封裝效率從 20% 提升至60%；為解決細(xì)胞逃逸問(wèn)題，采用雙重封裝策略（微凝膠包埋于非降解凝膠中），實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)達(dá)15 天的長(zhǎng)期培養(yǎng)，可觀察細(xì)胞活力、增殖和形態(tài)變化。該平臺(tái)為研究細(xì)胞與微環(huán)境的相互作用提供了精細(xì)工具。

1. 引言· 背景：3D 細(xì)胞培養(yǎng)比 2D 更接近原生微環(huán)境，但現(xiàn)有技術(shù)難以整合微環(huán)境多參數(shù)（如 ECM 剛度、可溶性信號(hào)）的**調(diào)控。

· 研究目標(biāo)：構(gòu)建基于微凝膠的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)微環(huán)境參數(shù)的精細(xì)調(diào)控，研究細(xì)胞對(duì)復(fù)雜微環(huán)境的響應(yīng)。

CERO 3D細(xì)胞(類***)生物反應(yīng)器

2. 結(jié)果與討論

2.1 微流控細(xì)胞封裝· 材料設(shè)計(jì)：采用 8 臂 PEG - 乙烯砜（VS），通過(guò)凝血因子 XIIIa（FXIIIa）酶促交聯(lián)；含 MMP 底物肽（GPQGIWGQ）的微凝膠可降解，含 GDQGIAGF 的為非降解型；RGD 肽促進(jìn)細(xì)胞粘附。

· 微流控裝置：四入口流動(dòng)聚焦設(shè)計(jì)，中間通道通入 PEG + 細(xì)胞混合液，側(cè)通道通入 FXIIIa + 鈣緩沖液及含表面活性劑的礦物油，形成單分散微凝膠（直徑 80-150 μm）。

· 封裝特性：細(xì)胞分布符合泊松分布，通過(guò)調(diào)節(jié)初始濃度控制每滴細(xì)胞數(shù)（0-2 個(gè)）；封裝后細(xì)胞活力達(dá) 90%（PI 染色）。

2.2 封裝效率優(yōu)化問(wèn)題：細(xì)胞與培養(yǎng)基密度差異（1.1 vs 1.0 g/mL）導(dǎo)致沉降，1 小時(shí)后封裝效率* 20%。

優(yōu)化措施：

l 添加 OptiPrep 調(diào)節(jié)密度：16% OptiPrep（100 μL 培養(yǎng)基中加 16 μL）在 0、30 分鐘時(shí)細(xì)胞數(shù)**多，適配成纖維細(xì)胞；*細(xì)胞（MDA-MB-231）和 ESCs 需 20% OptiPrep。

l 延長(zhǎng)胰蛋白酶處理：8 分鐘處理減少細(xì)胞聚集，結(jié)合 OptiPrep 使效率提升至 60%。

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2.3 防止細(xì)胞逃逸

· 現(xiàn)象：ESCs 在 20 小時(shí)后開(kāi)始逃逸，*細(xì)胞也存在類似問(wèn)題，與微凝膠特性和細(xì)胞類型相關(guān)。

· 解決方案：

· 方法 1：將微凝膠包埋于 200 μm 厚的非降解 PEG 凝膠（通過(guò) Michael 加成交聯(lián)），阻止細(xì)胞遷移；但不利于細(xì)胞回收。

· 方法 2：微流控雙重封裝（微凝膠再包埋于非降解 PEG 微珠中），結(jié)合 16% OptiPrep 使共封裝效率達(dá) 40%，實(shí)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞逃逸。2.4 長(zhǎng)期培養(yǎng)結(jié)果· 細(xì)胞活力：在 5% PEG（40 kPa）外層凝膠中，500 Pa 和 1000 Pa 微凝膠內(nèi)細(xì)胞 15 天存活率較高；10% PEG（100 kPa）外層凝膠因腫脹壓迫，細(xì)胞活力***下降。

· 細(xì)胞增殖：ESCs 在 500 Pa 微凝膠中 4 天內(nèi)體積增加 3 倍，1000 Pa 微凝膠中增加 2.5 倍且 4 天時(shí)有更多細(xì)胞死亡。3. 結(jié)論該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了微環(huán)境多參數(shù)的**調(diào)控，通過(guò)優(yōu)化封裝效率和解決細(xì)胞逃逸，可用于長(zhǎng)期研究細(xì)胞行為。未來(lái)可設(shè)計(jì)可選擇性降解的外層凝膠，以兼顧細(xì)胞限制與回收需求。

4. 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

· 材料：PEG 衍生物（8 臂 PEG-VS、4 臂 PEG-SH）、FXIIIa 酶、RGD 肽、OptiPrep 等。

· 微流控芯片：PDMS 材質(zhì)，通道深度 100-150 μm，流動(dòng)聚焦設(shè)計(jì)。

· 表征：流變學(xué)測(cè)彈性模量，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，活死染色評(píng)估活力。

關(guān)鍵問(wèn)題

該微流控細(xì)胞封裝平臺(tái)的**優(yōu)勢(shì)是什么？

**優(yōu)勢(shì)在于微環(huán)境參數(shù)的精細(xì)且**調(diào)控，包括：機(jī)械特性（通過(guò) PEG 濃度調(diào)節(jié)彈性 300-3000 Pa）、生化信號(hào)（如 RGD 肽介導(dǎo)細(xì)胞粘附）、降解性（含 MMP 底物或非降解肽）；同時(shí)結(jié)合微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)單分散微凝膠的高效制備，封裝效率可達(dá) 60%，并能通過(guò)雙重封裝實(shí)現(xiàn) 15 天長(zhǎng)期培養(yǎng)。

研究中如何解決細(xì)胞從微凝膠中逃逸的問(wèn)題？效果如何？

采用雙重封裝策略：將細(xì)胞負(fù)載微凝膠進(jìn)一步包埋于非降解 PEG 凝膠中（薄膜或微珠形式）。非降解凝膠通過(guò)小孔徑和高剛度阻止細(xì)胞遷移（包括阿米巴運(yùn)動(dòng)和間質(zhì)運(yùn)動(dòng)）。結(jié)果顯示，該方法可完全阻止細(xì)胞逃逸，使細(xì)胞在 15 天培養(yǎng)中保持在微凝膠內(nèi)，且能穩(wěn)定監(jiān)測(cè)活力、增殖和形態(tài)。

該研究對(duì)細(xì)胞生物學(xué)或再生醫(yī)學(xué)有何潛在應(yīng)用？

潛在應(yīng)用包括：系統(tǒng)研究微環(huán)境參數(shù)（如剛度、生化信號(hào)）對(duì)細(xì)胞命運(yùn)（如干細(xì)胞分化、*細(xì)胞侵襲）的影響；開(kāi)發(fā)高通量藥物篩選模型（基于可控微環(huán)境）；優(yōu)化細(xì)胞移植策略（通過(guò)微凝膠保護(hù)細(xì)胞免受免疫攻擊并調(diào)控其功能）。此外，平臺(tái)的參數(shù)可調(diào)性為 mechanotransduction（機(jī)械傳導(dǎo)）機(jī)制研究提供了工具。

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